Jak se provádí test na vzteklinu?

Vzteklina je zvláště nebezpečné onemocnění teplokrevných živočichů, vyznačující se těžkým poškozením centrální nervové soustavy, atypickým chováním, agresivitou, paralýzou, vedoucí až k smrti. Obvykle se vyskytuje v násilné formě (u většiny zvířat) nebo v tiché formě (netypická pro skot). Jde o zooantroponózu, představující pro člověka obrovské nebezpečí.

Podle Rospotrebnadzor bylo v období leden až prosinec 2015 v Ruské federaci registrováno 6 případů nakažení člověka virem vztekliny, což je dvakrát více než v roce 2014. V zemi bylo také registrováno 3739 48,8 případů onemocnění zvířat, hlásí Ústřední vědecko-metodická veterinární laboratoř. Z toho divoká zvířata tvoří 37,9 %, psi a kočky – 12,4 %, hospodářská zvířata – XNUMX % epizod.

Získaná data naznačují prudké zhoršení epizootické situace ohledně vztekliny, což nutí specialisty veterinární medicíny věnovat tomuto problému zvýšenou pozornost.

Nejúčinnější metodou kontroly vztekliny u zvířat je včasná imunoprofylaxe a diagnostika.

Původcem onemocnění je virus vztekliny Rabies lyssavirus.

Čeleď/ Čeleď – Rhabdoviridae;

Rod/ Rod – Lyssavirus;

Druh/ Druh – lyssavirus vztekliny.

Laboratorní diagnostické metody pro vzteklinu byly standardizovány. Nařízením Federální agentury pro technickou regulaci a metrologii ze dne 30. září 09 č. 2013-st byla 1127. ledna 26075 zavedena mezistátní norma GOST 2013-1 jako národní norma Ruské federace.

Tato norma platí pro všechny druhy savců a stanoví následující metody pro laboratorní diagnostiku vztekliny: fluorescenční protilátková metoda (MFA); způsob izolace viru vztekliny v buněčné kultuře myšího neuroblastomu CCL-131 (nebo krysího gangliového neuromu Gasserova – NGUK-1); biotest na bílých myších; metoda enzymového imunotestu (ELISA); difúzní srážecí reakce (DPR).

Pro diagnostiku se používají:

1. Fluorescenční protilátková metoda. Detekce antigenu viru vztekliny pomocí fluorescein isothiokyanátem značených protilátek proti vzteklině s tvorbou charakteristických světélkujících inkluzních komplexů detekovaných v zorném poli fluorescenčního mikroskopu.

K detekci virového antigenu v nátěrech otisků mozku se používají přímé a nepřímé imunofluorescenční reakce. Nátěry jsou fixovány ve studeném acetonu po dobu 8-10 hodin při teplotě 4°C a zpracovávány ve vlhké komoře po dobu 30 minut. Imunoglobulin proti vzteklině značený FITC se promyje fosfátovým pufrem, suší se a zkoumá se pod fluorescenčním mikroskopem. Virové antigeny jsou pozorovány ve formě zelených granulí různých tvarů a velikostí. Pokud je výsledek negativní, jsou nutné další diagnostické metody.

2. Způsob izolace viru v buněčné kultuře myšího neuroblastomu CCL-131. Je založena na reprodukci viru v buněčné kultuře a jeho identifikaci pomocí fluorescenčních protilátek.

Suspendovaný Pat. materiál se zavede do buněčné kultury a jamky se ponechají pro kontrolu. Pozitivní kontrola je suspenze myšího mozku s kmenem CVS viru vztekliny, negativní kontrola je suspenze mozku klinicky zdravé myši. Poté inkubujte ve vlhkém CO₂ inkubátor obsahující 5 CO₂% při 37±1 °C po dobu 42-28 hodin. Osušte, fixujte ve studeném acetonu po dobu 30 minut a znovu vysušte. Poté, s přidáním PAH v pracovním ředění, se umístí do vlhké Petriho misky a inkubuje se při 37±1 °C po dobu 30 minut. Po dokončení třikrát promyjte, ponořte na 10 minut do nádoby s PBS, opláchněte destilovanou vodou a osušte. Nefluorescenční imerzní olej je aplikován a pozorován pod fluorescenčním mikroskopem. Antigen viru vztekliny je detekován v cytoplazmě buněčné kultury ve formě jasně zelených granulí různých tvarů s jasnými okraji.

3. Metoda biotestu. Izolace viru vztekliny u bílých myší injekcí suspenze patologického materiálu s následnou identifikací viru pomocí fluorescenčních protilátek.

Nejvhodnější pro infekci jsou sající myši. K provedení biologického testu se použije 15-20 zvířat. Infekce se provádí v anestezii intracerebrální injekcí 0,03 ml suspenze testovaného materiálu. Pokud je v testovaném materiálu přítomen virus vztekliny, myši pociťují svalový třes a paralýzu. Ve většině případů zvířata umírají do pěti dnů. Přítomnost viru vztekliny u infikovaných a mrtvých myší musí být potvrzena pomocí přímé imunofluorescence nebo detekcí těl Babes-Negri. Identifikace detekovaného viru vztekliny se také provádí pomocí neutralizační reakce na bílých myších.

4. Enzymová imunoanalytická metoda. (ELISA) Na základě specifické interakce virového antigenu s protilátkou proti vzteklině imobilizovanou na pevném nosiči s následnou detekcí navázaného antigenu pomocí druhé protilátky značené enzymem obarvením reakčního produktu chromogenem.

ELISA se provádí v „sendvičové“ verzi. Gamaglobulin je imobilizován na pevné fázi. Testovaný vzorek se přidá do jamek panelů a paralelně se umístí pozitivní kontrolní vzorek a negativní kontrolní vzorek v různých ředěních. Inkubujte a omyjte. Do jamek se přidá konjugát peroxidázy proti vzteklině. Po inkubaci se provede promytí. Přidá se substrát a inkubuje se. Reakce se zastaví, když se dosáhne optimálního barvení v jamkách s pozitivní kontrolou. Negativní výsledek je třeba potvrdit jinými diagnostickými metodami.

5. Difúzní srážecí reakce. Metoda založená na schopnosti protilátek a virového antigenu vztekliny difundovat v agarovém gelu a po specifické interakci vytvořit komplex antigen-protilátka, pozorovaný jako precipitační linie.

Do připravených jamek v agarovém gelu se přidají hotové ředění séra proti vzteklině. Petriho misky se umístí do termostatu při 37±1 °C na 48 hodin. Reakce je považována za pozitivní, když se mezi jamkami obsahujícími mozkovou suspenzi a gama globulin vztekliny objeví jedna nebo 2-3 linie srážení jakékoli intenzity. Negativní výsledek je potvrzen jinými metodami.

Vzhledem k vysokému nebezpečí onemocnění v důsledku úplné úmrtnosti musí veterinární lékař vědět, že konečnou diagnózu lze stanovit pouze laboratorními diagnostickými metodami. Proto je obtížné přeceňovat význam výše uvedených metod pro praktickou veterinární medicínu.

Bibliografický seznam

1. Gaisarov, M.S. Epizootologická charakteristika zvířecí vztekliny v Republice Bashkortostan, prevence a opatření pro boj s ní [Text]: abstrakt práce. Ph.D. biol. Vědy: 16.00.03 / Gaisarov M. S.; Baškirská státní agrární univerzita. — Ufa: [b. i.], 2009. s. 18-19
2. Gulyukin, A.M. Význam moderních metod laboratorní diagnostiky a identifikace patogena vztekliny pro imunologické sledování této zoonózy [Text] / A.M. Gulyukin // M.: Otázky virologie č. 3, 2014 – str. 5-10.
3. Masimov, N.A. Infekční onemocnění psů a koček. [Elektronický zdroj] / N.A. Masimov, S.I. Lebedko. — Elektron. Dan. – Petrohrad. : Lan, 2009. – 128 s. — Režim přístupu: http://e.lanbook.com/book/256
4. Metody laboratorní diagnostiky vztekliny. [Text]: GOST 26075-2013 – Úvod. 2015-01-01. – M.: Gosstandart Ruska, 2013. – 19 s.